巨噬细胞培养上清液对HL-60细胞端粒酶活性的影响研究
作者：周剑芳 汤为学 程平艳
单位：周剑芳 重庆医科大学98级研究生(重庆400046)；汤为学 重庆医科大学病理生理教研室；程平艳 Dept.of Biochemistry,University of Medical Sciences,USA
关键词：端粒酶；巨噬细胞；HL-60细胞；维甲酸；细胞周期
肿瘤990604 中图分类号：R733.7，Q55 文章标识码：A 文章编号：1000-7431(1999)06-0331-04
摘要：目的 探讨影响端粒酶活性因素及可能机理。方法 使用PCR-ELISA法半定量检测端粒酶活性，并进行细胞周期、形态学观察。以人类早幼粒白血病细胞HL-60(Ⅰ)和全反式维甲酸(ATRA5μM)处理72 h的HL-60细胞(Ⅱ)为实验对象。再用一定浓度的小鼠腹腔巨噬细胞培养上清液(MCS)体外刺激实验细胞。结果 实验细胞Ⅱ在5% MCS作用下，较对照无明显差异；受20 % MCS作用48 h，端粒酶活性可明显上调(P<0.05)，在第3天酶活性下降；在20%、40% MCS作用下较对照均明显增高(P<0.05)，但两者(20%与40%)间无明显差异；MCS直接作用实验细胞Ⅰ、Ⅱ的端粒酶提取物，未见端粒酶活性明显变化。实验细胞Ⅱ在持续的MCS作用下培养2周，恢复恶性增殖能力。端粒酶活性变化受细胞群主体分布影响不大。MCS作用于具有高端粒酶活性的实验细胞Ⅰ，未发现明显促进作用。无MCS的培养体系中，小牛血清浓度不影响实验细胞Ⅰ、Ⅱ的端粒酶活性。结论 ATRA处理的HL-60细胞的端粒酶是可调节的，未活化的巨噬细胞培养上清液可对其活性进行有效上调，而对HL-60细胞高水平表达的端粒酶活性影响不大。
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STUDY ON TELOMERASE ACTIVITY IN HL-60 CELLS STIMULATED BY SUPERNATANT OF CULTURED MACROPHAGE
ZHOU Jian-fang,TANG Wei-xue,CHENG Ping-yan.
(Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400046,China)
Abstract：Objective Study on the factors influencing telomerase activity and the possible mechanism.Methods Telomerase activity were analyzed by PCR-ELISA as well as cell cycle and morphology in human promyeloid leukemia HL-60 cells. HL-60 cells were treated in group Ⅱ with or in group Ⅰ without all-trans-retonic acid(ATRA) and,then were stimulated by supernatant of cultrued murine peritoneal macrophage. Results After about 48-hour culture of group Ⅱ in the presence of 20% supernatant,telomerase activity was significantly up-regulated (P<0.05) and was decreased on day 3.As compared with group Ⅰ,20% or 40% supernatant could up-regulate telomerase activity of group Ⅱ significantly (P<0.05). Two-week culture of group Ⅱ with persistent supernatant could direct HL-60 resuming its malignant status.Conclusions The telomerase activity in ATRA-treated HL-60 cells can be regulated, and supernatant of cultured inactive macrophage can up-regulated the activity effectively,but has littel influence on the high telomerase activity in HL-60 cells.
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Key words： Telomerase；Macrophage；HL-60 cells；Tretinoin；Cell cycle
巨噬细胞(Mφ)为多功能间质细胞，在体内具有双重性作用。一方面发挥重要的免疫防护功能，另一方面由肿瘤衍生的趋化因子引进肿瘤内的单核巨噬细胞，在肿瘤生长旺盛期受不同内环境的影响，对肿瘤细胞的免疫监视、免疫清除功能降低，反而促进肿瘤的生长和转移[1]。Gorelin报道未活化巨噬细胞和瘤细胞直接接触，有促进瘤细胞生长的作用[2]。陈慰峰[3]、王宗惠[4]报道未活化巨噬细胞培养上清液(MCS)具有促进杂交瘤/瘤细胞生长的生物活性物质的存在。端粒酶则是近年肿瘤研究领域的新热点，瘤细胞的永生性与端粒酶活性有关。对于巨噬细胞促进瘤细胞生长及杂交瘤细胞成活机理尚不清楚，而MCS能否上调瘤细胞端粒酶活性亦未见报道。本文将实验研究结果报道于下。
材料与方法
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一、材料
1、动物BALB/c小鼠，9～12周龄，雄性。由本校动物中心提供。
2、巨噬细胞培养上清液(MCS)制备 禁食8 h小鼠，断颈处死小鼠，收集腹腔渗出细胞，加入RPMI 1640培养液，混匀后置37℃，5% CO2饱和湿度温箱内培养3 h，除去非贴壁细胞，加入RPMI 1640培养液(10% FCS)，调整至106个细胞/ml，培养1周，制备培养上清液，-20℃保存备用，用前室温融化。
3、实验细胞 实验细胞Ⅰ、人类早幼粒白血病细胞HL-60(军科院药理研究室提供)取对数生长期细胞。
实验细胞Ⅱ、全反式维甲酸(ATRA Sigma)处理的HL-60细胞 ATRA用无水乙醇配制成10-2mol/L，置于-20℃避光保存，用RPMI 1640稀释成工作液浓度。指数生长期HL-60细胞以2×105/ml密度种于100 ml培养瓶内，ATRA终浓度5 μmol/L，避光在37 ℃ 5% CO2条件下培养72 h，1000 r/min离心5 min收集细胞，用Hank′s液洗涤2次，所获得的细胞作为实验材料。
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二、方法
1.RT-PCR测定端粒酶活性(Telomerase PCR ELISA试剂盒Boehringer Mannheim)
收集待测细胞，用Hank′s液洗涤2次，取106细胞加200 μl CHAPS裂解液冰浴30 min，低温离心机中4℃ 12 000 g离心20 min。取175 μl上清-80 ℃保存待测。
取2 μl细胞提取物，按药盒说明书，加入反应底物，总体积为50 μl，30 ℃逆转30 min，在Bio-Rad 2400 PCR扩增仪(Bio-Rad美国)经94 ℃ 5 min灭活后经94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s 30个循环，72 ℃ 10 min扩增。PCR产物4 ℃保存。
按药盒说明书，取5 μl PCR反应产物加入20 μl变性液中，室温放置10 min，再加入225 μl杂交液，充分混匀，取100 μl加入亲和素包被的96孔板内。该试剂盒利用亲和素吸附固定由端粒酶逆转录再经PCR扩增的产物，加入特异性的地高辛标记的核苷酸探针和抗DIG-POD抗体半定量检测，底物为TMB。在自动酶标仪上比色，测量OD值，波长为450 nm，690 nm。重复3次，双孔平行。待测孔OD值=OD450值-OD690值，阴性对照<0.2，阳性对照>1.0为有效测定，方可判定实验结果。实验分5组：(1)常规培养不同时间的实验细胞Ⅰ、Ⅱ。(2)培养体系含不同浓度的小牛血清的实验细胞Ⅰ、Ⅱ。(3)培养体系含不同浓度的MCS的实验细胞Ⅱ，以无MCS的作自身对照。(4)MCS作用不同时间的实验细胞Ⅰ、Ⅱ，分别以无MCS的作为自身对照。(5)MCS作用实验细胞Ⅰ、Ⅱ端粒酶提取物即各取10 μl新鲜制备细胞Ⅰ、Ⅱ的端粒酶提取物与10 μl MCS 25 ℃温育30 min，取混合物4 μl加入PCR反应体系，测定端粒酶活性。
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2.细胞周期分析-流式细胞光度术
收获细胞，70 %乙醇40℃固定4 h以上，用碘化丙啶(DAPI)染色，FACS Calibar流式细胞仪(B.D美国)，作DNA单参数分析，以正常人淋巴细胞作对照，所得数据采用仪器程序cell quest计算各期细胞比例。实验分2组：(1)MCS培养48 h的实验细胞Ⅰ及无MCS的自身对照。(2)MCS培养不同时间的实验细胞Ⅱ及无MCS的自身对照。
3.透射电镜检查
收集细胞用2.5%戊二醛固定，继用2%四氧化锇固定，脱水、包埋、切片和染色按常规处理。实验分2组：(1)实验细胞Ⅰ、Ⅱ。(2)实验细胞Ⅱ在10% FCS、40% MCS RPMI中培养，对照为实验细胞Ⅱ在10% FCS 无MCS RPMI 1640中培养，培养2周，隔3～4天，弃一半培养液，加入新鲜培养液，成分组成不变。因对照细胞量不足，未能电镜检查。
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结果
一、端粒酶活性测定
收集常规培养条件下培养0 h、24 h、48 h、72 h、96 h实验细胞Ⅰ、Ⅱ检测实验细胞Ⅰ表达高端粒酶活性，OD值为0.997～1.105，较稳定，0 h测OD值为1.102±0.089。实验细胞Ⅱ端粒酶活性明显降低，培养0 h测OD值为0.511±0.167(P<0.01)，为原酶活性的40%～50%，后逐渐降低，96 h OD值为0.202，接近阴性对照。
2.收集含5 %、10 %、15 %、20 %小牛血清培养48 h的实验细胞Ⅰ、Ⅱ检测
小牛血清浓度不影响端粒酶活性，实验细胞Ⅰ的OD值为0.972～1.166，实验细胞Ⅱ的OD值为0.508～0.572，故选用常规10% FCS RPMI 1640培养。因使用无血清培养条件下待测细胞数目不能满足，未能测定无血清培养对端粒酶活性影响。
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3. 5 %、20 %、40 % MCS作用实验细胞Ⅱ 48 h检验
实验组细胞较未经MCS作用的对照细胞端粒酶活性均增高，分为0.522±0.11、0.806±0.16、0.925±0.09，对照组为0.367±0.13，实验组中后2组较对照有统计学意义(P<0.05)，但两者(20%与40% MSC实验结果)间无明显差异，提示20% MCS已足以提高端粒酶活性。以20 % MCS作用于实验细胞Ⅱ 48 h重复测定6次，实验组为0.826±0.229，较对照组0.411±0.208明显增高(P<0.05)。
4.MCS对实验细胞端粒酶活性影响的时效关系
MCS对实验细胞Ⅰ端粒酶活性影响不大(见图1)，实验细胞Ⅱ在20%的MCS作用下，24 h内即有明显上调，可持续作用48 h左右，培养第3天时有所降低，仍高于对照，但无明显差异(见图2)。
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图1 20% MCS对实验细胞Ⅰ端粒酶活性影响
图2 20% MCS对实验细胞Ⅱ端粒酶活性影响
5.经MCS作用的实验细胞端粒酶提取物检测
实验细胞Ⅰ端粒酶提取物经MCS作用后测其酶活性OD 1.104±0.03，实验细胞Ⅱ端粒酶提取物经MCS作用测其酶活性OD值0.411±0.13，与实验细胞提取物的酶活性(实验细胞I 0 h OD值为1.102±0.089；实验细胞Ⅱ细胞0 h OD值为0.511±0.167)无明显差异(P>0.05)。
二、细胞周期检测 见表1，2。
表1 实验细胞Ⅰ受20% MCS作用48 h细胞周期移行
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细胞周期分布(%)
G1/G0
S
G2+M
实验组
38.26
53.65
8.10
对照组
40.95
47.96
11.08
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表2 实验细胞Ⅱ受20%MCS作用不同时间细胞周期移行
重培养时间
细胞周期分布(%)
G1/G0
S
G2+M
实验组
0 h
56.46
18.30
25.24
, 百拇医药 24h
57.25
9.10
23.65
48 h
70.85
9.20
19.94
对照组
24 h
62.56
10.95
26.50
, 百拇医药
48 h
64.00
11.62
24.38
三、透射电镜检查
实验细胞Ⅱ，在40% MCS持续作用下培养，最初存活细胞体积小，数量少，1周后逐渐恢复其恶性生长增殖行为。细胞大小不一，悬浮生长，核大呈圆形。对照组细胞，存活细胞量少，培养体系中也能见少许幼稚，大小不一的细胞。讨论
端粒酶，是由RNA和蛋白质构成的核糖核蛋白复合物，能利用自身携带的RNA模板逆转录合成端粒DNA(TTAGGG)，用以维持因细胞分裂而缩短的端粒结构，从而使细胞获得无限增殖能力，成为永生化细胞[6]。Bestilny报道HL-60细胞在ATRA作用下，24 h内即有端粒酶活性降低，72 h后酶活性则可降低到原来的25%以下，而第4天甚至检测不到酶活性，此时可见细胞形态学改变[5]。本实验使用5 μmol/L ATRA连续诱导HL-60细胞72 h，发现端粒酶活性明显降低，仅为原水平的40%～50%，撤药后再培养时逐渐降低，第4天OD值接近阴性对照。且细胞生长明显抑制，细胞主体由S期(50.13%)移行到G1/G0(56.46%)，撤药后细胞继续进入G1/G0期(静息期)。受作用细胞呈现分化细胞特征即出现杆状核，异染色质成分增多，也见细胞凋亡征象。使用粗制的未活化的巨噬细胞培养上清作用于HL-60细胞，对高水平表达的端粒酶活性表现不出明显上调效应，经ATRA处理的HL-60细胞已降低的端粒酶活性可有效地上调，且发挥效应快。实验中使用5 %、20 %、40 % MCS可上调端粒酶活性，后两者的上调效应较对照有明显差异，提示未活化的腹腔巨噬细胞培养上清液中含有上调端粒酶活性的生物活性物质，且MCS上调端粒酶活性效应与活性物质含量正相关，而这类活性物质对高水平表达的端粒酶活性不足以进一步提高。Holt[7，8]等提出永生细胞端粒酶活性和细胞周期有关：即肿瘤细胞在G1/G0期开始表达端粒酶活性，到S期达峰值，在G2/M期几乎不表达端粒酶活性。也有报道用HT1080和HL-60试验发现白血病细胞周期中的各期细胞端粒酶活性无明显差异[8]。实验细胞Ⅰ受MCS 48 h作用后细胞进入S期有所增加，而端粒酶活性无明显变化。实验细胞Ⅱ受MCS作用，细胞进入G1/G0期增加，但端粒酶活性明显增高，提示在HL-60细胞中端粒酶活性与细胞周期关系不大。而以MCS直接作用于实验细胞的端粒酶提取物未发现酶活性明显变化，说明MCS不是通过化学或直接的生化作用，而是通过细胞发挥效应。实验结果提示诱导分化剂ATRA处理的HL-60细胞的端粒酶是可调节的，未活化的巨噬细胞培养上清液可有效上调其活性，而对HL-60细胞高水平表达的端粒酶活性影响不大。韩锐等[9]报道ATRA通过促进PKC活性及与核膜受体RARα结合，进入胞核，作用于靶基因而发挥诱导分化效应的，MCS上调ATRA处理的HL-60细胞端粒酶活性有可能通过拮抗以上的有关途径或其他未知环节来影响端粒酶活性。巨噬细胞促进肿瘤的生长存在细胞间的直接作用[2]，巨噬细胞又是分泌活性细胞，其产生多种生物活性因子在肿瘤细胞生长增殖中亦表现出复杂的作用，未活化的巨噬细胞培养上清可促进杂交瘤/瘤细胞生长增殖[3，4]。王宗惠[4]报道未活化的巨噬细胞培养上清液中存在具有促进NS-1、K562肿瘤增殖，提高YAC-1、L1210存活率的生物活性物质，这种生物活性物质是不同于白细胞介素1、6的。而活化的巨噬细胞培养上清液中的主要成分IL-1、TNF-α、IFN-γ具有杀伤瘤细胞效应。本实验中MCS短时间作用于ATRA处理的HL-60不能阻止细胞周期继续移行到G1/G0期；但在MCS持续作用2周后，细胞恢复恶性增殖状态，且生长代谢旺盛，多见核分裂相，胞浆内富含核糖体及高尔基体等细胞器。培养2周的对照组细胞存活量少，也见少量幼稚、大小不一的细胞，可能是少量对ATRA无反应的HL-60细胞群体部分[5]。其可能是一方面通过上调端粒酶活性，逆转分化细胞群体向恶性化发展或MCS促进对ATRA无反应的HL-60细胞群体增殖达到的。
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本文观察了MCS对HL-60细胞端粒酶活性影响，初步探讨其可能的作用机制。早衰综合征[10]、骨髓发育不良综合征患者细胞的端粒长度明显短于同年龄组正常人，利用MCS中这类上调端粒酶活性的物质用于早衰、骨髓发育不良综合征的预防和治疗是有可能的。
基金项目：四川省教委基金资助(川教科1996D027)
作者简介：周剑芳，女，硕士学位，在读博士生。
参考文献
[1]Nelson M,Nelson DS.Stimulation of proliferation in mixed cultures of mouse tumor cells and non-immune peritoneal cells;occurrence of stimulation and cyclical variation in tumor cell activity〔J〕.J Natl Cancer Int,1985,74(3):6271
, http://www.100md.com
[2]Gorelin E.Inhibition of cytokine production by a tumor cell product〔J〕. Int J Cancer,1982,29:575
[3]陈慰峰，李 萌.巨噬细胞活性因子的双相效应及巨噬细胞的促瘤细胞生长作用〔J〕.中国免疫学杂志，1989，5：144
[4]王宗惠，庞祈民，苏 英，等.未活化巨噬细胞对杂交瘤/瘤细胞作用的研究〔J〕.肿瘤防治研究，1993，20：90
[5]Bestilny, Brown CB, Miura Y, et al.Selective inhibition of telomerase activity during terminal differentiation of immortal cell lines〔J〕.Cancer Res,1996,50:5795
, 百拇医药
[6]Kim HW,Piatyszek MA.Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cell and cancer〔J〕. Science,1994,266:2011
[7]Zhu XL,Kumar R,Mandal M, et al. Cell cycle-dependent modulation of telomerase activity in tumor cells〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA,Cell Biol,1996,93:6091
[8]Holt SE,Wright WE,Shay JW, et al. Regulation of telomerase activity in immortal cell lines〔J〕. Mol Cell Biol,1996,16:2932
[9]韩 锐主编.抗癌药物研究与实验技术〔M〕.北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1997：59
[10]Allosp RC,Vaziri H,Patterson C, et al. Telomere length predictive replicative capacity of human fibroblasts〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:101128
(收稿日期：1998-06-18 修回日期：1998-09-10), 百拇医药
单位：周剑芳 重庆医科大学98级研究生(重庆400046)；汤为学 重庆医科大学病理生理教研室；程平艳 Dept.of Biochemistry,University of Medical Sciences,USA
关键词：端粒酶；巨噬细胞；HL-60细胞；维甲酸；细胞周期
肿瘤990604 中图分类号：R733.7，Q55 文章标识码：A 文章编号：1000-7431(1999)06-0331-04
摘要：目的 探讨影响端粒酶活性因素及可能机理。方法 使用PCR-ELISA法半定量检测端粒酶活性，并进行细胞周期、形态学观察。以人类早幼粒白血病细胞HL-60(Ⅰ)和全反式维甲酸(ATRA5μM)处理72 h的HL-60细胞(Ⅱ)为实验对象。再用一定浓度的小鼠腹腔巨噬细胞培养上清液(MCS)体外刺激实验细胞。结果 实验细胞Ⅱ在5% MCS作用下，较对照无明显差异；受20 % MCS作用48 h，端粒酶活性可明显上调(P<0.05)，在第3天酶活性下降；在20%、40% MCS作用下较对照均明显增高(P<0.05)，但两者(20%与40%)间无明显差异；MCS直接作用实验细胞Ⅰ、Ⅱ的端粒酶提取物，未见端粒酶活性明显变化。实验细胞Ⅱ在持续的MCS作用下培养2周，恢复恶性增殖能力。端粒酶活性变化受细胞群主体分布影响不大。MCS作用于具有高端粒酶活性的实验细胞Ⅰ，未发现明显促进作用。无MCS的培养体系中，小牛血清浓度不影响实验细胞Ⅰ、Ⅱ的端粒酶活性。结论 ATRA处理的HL-60细胞的端粒酶是可调节的，未活化的巨噬细胞培养上清液可对其活性进行有效上调，而对HL-60细胞高水平表达的端粒酶活性影响不大。
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STUDY ON TELOMERASE ACTIVITY IN HL-60 CELLS STIMULATED BY SUPERNATANT OF CULTURED MACROPHAGE
ZHOU Jian-fang,TANG Wei-xue,CHENG Ping-yan.
(Chongqing University of Medical Sciences,Chongqing 400046,China)
Abstract：Objective Study on the factors influencing telomerase activity and the possible mechanism.Methods Telomerase activity were analyzed by PCR-ELISA as well as cell cycle and morphology in human promyeloid leukemia HL-60 cells. HL-60 cells were treated in group Ⅱ with or in group Ⅰ without all-trans-retonic acid(ATRA) and,then were stimulated by supernatant of cultrued murine peritoneal macrophage. Results After about 48-hour culture of group Ⅱ in the presence of 20% supernatant,telomerase activity was significantly up-regulated (P<0.05) and was decreased on day 3.As compared with group Ⅰ,20% or 40% supernatant could up-regulate telomerase activity of group Ⅱ significantly (P<0.05). Two-week culture of group Ⅱ with persistent supernatant could direct HL-60 resuming its malignant status.Conclusions The telomerase activity in ATRA-treated HL-60 cells can be regulated, and supernatant of cultured inactive macrophage can up-regulated the activity effectively,but has littel influence on the high telomerase activity in HL-60 cells.
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Key words： Telomerase；Macrophage；HL-60 cells；Tretinoin；Cell cycle
巨噬细胞(Mφ)为多功能间质细胞，在体内具有双重性作用。一方面发挥重要的免疫防护功能，另一方面由肿瘤衍生的趋化因子引进肿瘤内的单核巨噬细胞，在肿瘤生长旺盛期受不同内环境的影响，对肿瘤细胞的免疫监视、免疫清除功能降低，反而促进肿瘤的生长和转移[1]。Gorelin报道未活化巨噬细胞和瘤细胞直接接触，有促进瘤细胞生长的作用[2]。陈慰峰[3]、王宗惠[4]报道未活化巨噬细胞培养上清液(MCS)具有促进杂交瘤/瘤细胞生长的生物活性物质的存在。端粒酶则是近年肿瘤研究领域的新热点，瘤细胞的永生性与端粒酶活性有关。对于巨噬细胞促进瘤细胞生长及杂交瘤细胞成活机理尚不清楚，而MCS能否上调瘤细胞端粒酶活性亦未见报道。本文将实验研究结果报道于下。
材料与方法
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一、材料
1、动物BALB/c小鼠，9～12周龄，雄性。由本校动物中心提供。
2、巨噬细胞培养上清液(MCS)制备 禁食8 h小鼠，断颈处死小鼠，收集腹腔渗出细胞，加入RPMI 1640培养液，混匀后置37℃，5% CO2饱和湿度温箱内培养3 h，除去非贴壁细胞，加入RPMI 1640培养液(10% FCS)，调整至106个细胞/ml，培养1周，制备培养上清液，-20℃保存备用，用前室温融化。
3、实验细胞 实验细胞Ⅰ、人类早幼粒白血病细胞HL-60(军科院药理研究室提供)取对数生长期细胞。
实验细胞Ⅱ、全反式维甲酸(ATRA Sigma)处理的HL-60细胞 ATRA用无水乙醇配制成10-2mol/L，置于-20℃避光保存，用RPMI 1640稀释成工作液浓度。指数生长期HL-60细胞以2×105/ml密度种于100 ml培养瓶内，ATRA终浓度5 μmol/L，避光在37 ℃ 5% CO2条件下培养72 h，1000 r/min离心5 min收集细胞，用Hank′s液洗涤2次，所获得的细胞作为实验材料。
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二、方法
1.RT-PCR测定端粒酶活性(Telomerase PCR ELISA试剂盒Boehringer Mannheim)
收集待测细胞，用Hank′s液洗涤2次，取106细胞加200 μl CHAPS裂解液冰浴30 min，低温离心机中4℃ 12 000 g离心20 min。取175 μl上清-80 ℃保存待测。
取2 μl细胞提取物，按药盒说明书，加入反应底物，总体积为50 μl，30 ℃逆转30 min，在Bio-Rad 2400 PCR扩增仪(Bio-Rad美国)经94 ℃ 5 min灭活后经94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s 30个循环，72 ℃ 10 min扩增。PCR产物4 ℃保存。
按药盒说明书，取5 μl PCR反应产物加入20 μl变性液中，室温放置10 min，再加入225 μl杂交液，充分混匀，取100 μl加入亲和素包被的96孔板内。该试剂盒利用亲和素吸附固定由端粒酶逆转录再经PCR扩增的产物，加入特异性的地高辛标记的核苷酸探针和抗DIG-POD抗体半定量检测，底物为TMB。在自动酶标仪上比色，测量OD值，波长为450 nm，690 nm。重复3次，双孔平行。待测孔OD值=OD450值-OD690值，阴性对照<0.2，阳性对照>1.0为有效测定，方可判定实验结果。实验分5组：(1)常规培养不同时间的实验细胞Ⅰ、Ⅱ。(2)培养体系含不同浓度的小牛血清的实验细胞Ⅰ、Ⅱ。(3)培养体系含不同浓度的MCS的实验细胞Ⅱ，以无MCS的作自身对照。(4)MCS作用不同时间的实验细胞Ⅰ、Ⅱ，分别以无MCS的作为自身对照。(5)MCS作用实验细胞Ⅰ、Ⅱ端粒酶提取物即各取10 μl新鲜制备细胞Ⅰ、Ⅱ的端粒酶提取物与10 μl MCS 25 ℃温育30 min，取混合物4 μl加入PCR反应体系，测定端粒酶活性。
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2.细胞周期分析-流式细胞光度术
收获细胞，70 %乙醇40℃固定4 h以上，用碘化丙啶(DAPI)染色，FACS Calibar流式细胞仪(B.D美国)，作DNA单参数分析，以正常人淋巴细胞作对照，所得数据采用仪器程序cell quest计算各期细胞比例。实验分2组：(1)MCS培养48 h的实验细胞Ⅰ及无MCS的自身对照。(2)MCS培养不同时间的实验细胞Ⅱ及无MCS的自身对照。
3.透射电镜检查
收集细胞用2.5%戊二醛固定，继用2%四氧化锇固定，脱水、包埋、切片和染色按常规处理。实验分2组：(1)实验细胞Ⅰ、Ⅱ。(2)实验细胞Ⅱ在10% FCS、40% MCS RPMI中培养，对照为实验细胞Ⅱ在10% FCS 无MCS RPMI 1640中培养，培养2周，隔3～4天，弃一半培养液，加入新鲜培养液，成分组成不变。因对照细胞量不足，未能电镜检查。
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结果
一、端粒酶活性测定
收集常规培养条件下培养0 h、24 h、48 h、72 h、96 h实验细胞Ⅰ、Ⅱ检测实验细胞Ⅰ表达高端粒酶活性，OD值为0.997～1.105，较稳定，0 h测OD值为1.102±0.089。实验细胞Ⅱ端粒酶活性明显降低，培养0 h测OD值为0.511±0.167(P<0.01)，为原酶活性的40%～50%，后逐渐降低，96 h OD值为0.202，接近阴性对照。
2.收集含5 %、10 %、15 %、20 %小牛血清培养48 h的实验细胞Ⅰ、Ⅱ检测
小牛血清浓度不影响端粒酶活性，实验细胞Ⅰ的OD值为0.972～1.166，实验细胞Ⅱ的OD值为0.508～0.572，故选用常规10% FCS RPMI 1640培养。因使用无血清培养条件下待测细胞数目不能满足，未能测定无血清培养对端粒酶活性影响。
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3. 5 %、20 %、40 % MCS作用实验细胞Ⅱ 48 h检验
实验组细胞较未经MCS作用的对照细胞端粒酶活性均增高，分为0.522±0.11、0.806±0.16、0.925±0.09，对照组为0.367±0.13，实验组中后2组较对照有统计学意义(P<0.05)，但两者(20%与40% MSC实验结果)间无明显差异，提示20% MCS已足以提高端粒酶活性。以20 % MCS作用于实验细胞Ⅱ 48 h重复测定6次，实验组为0.826±0.229，较对照组0.411±0.208明显增高(P<0.05)。
4.MCS对实验细胞端粒酶活性影响的时效关系
MCS对实验细胞Ⅰ端粒酶活性影响不大(见图1)，实验细胞Ⅱ在20%的MCS作用下，24 h内即有明显上调，可持续作用48 h左右，培养第3天时有所降低，仍高于对照，但无明显差异(见图2)。
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图1 20% MCS对实验细胞Ⅰ端粒酶活性影响
图2 20% MCS对实验细胞Ⅱ端粒酶活性影响
5.经MCS作用的实验细胞端粒酶提取物检测
实验细胞Ⅰ端粒酶提取物经MCS作用后测其酶活性OD 1.104±0.03，实验细胞Ⅱ端粒酶提取物经MCS作用测其酶活性OD值0.411±0.13，与实验细胞提取物的酶活性(实验细胞I 0 h OD值为1.102±0.089；实验细胞Ⅱ细胞0 h OD值为0.511±0.167)无明显差异(P>0.05)。
二、细胞周期检测 见表1，2。
表1 实验细胞Ⅰ受20% MCS作用48 h细胞周期移行
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细胞周期分布(%)
G1/G0
S
G2+M
实验组
38.26
53.65
8.10
对照组
40.95
47.96
11.08
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表2 实验细胞Ⅱ受20%MCS作用不同时间细胞周期移行
重培养时间
细胞周期分布(%)
G1/G0
S
G2+M
实验组
0 h
56.46
18.30
25.24
, 百拇医药 24h
57.25
9.10
23.65
48 h
70.85
9.20
19.94
对照组
24 h
62.56
10.95
26.50
, 百拇医药
48 h
64.00
11.62
24.38
三、透射电镜检查
实验细胞Ⅱ，在40% MCS持续作用下培养，最初存活细胞体积小，数量少，1周后逐渐恢复其恶性生长增殖行为。细胞大小不一，悬浮生长，核大呈圆形。对照组细胞，存活细胞量少，培养体系中也能见少许幼稚，大小不一的细胞。讨论
端粒酶，是由RNA和蛋白质构成的核糖核蛋白复合物，能利用自身携带的RNA模板逆转录合成端粒DNA(TTAGGG)，用以维持因细胞分裂而缩短的端粒结构，从而使细胞获得无限增殖能力，成为永生化细胞[6]。Bestilny报道HL-60细胞在ATRA作用下，24 h内即有端粒酶活性降低，72 h后酶活性则可降低到原来的25%以下，而第4天甚至检测不到酶活性，此时可见细胞形态学改变[5]。本实验使用5 μmol/L ATRA连续诱导HL-60细胞72 h，发现端粒酶活性明显降低，仅为原水平的40%～50%，撤药后再培养时逐渐降低，第4天OD值接近阴性对照。且细胞生长明显抑制，细胞主体由S期(50.13%)移行到G1/G0(56.46%)，撤药后细胞继续进入G1/G0期(静息期)。受作用细胞呈现分化细胞特征即出现杆状核，异染色质成分增多，也见细胞凋亡征象。使用粗制的未活化的巨噬细胞培养上清作用于HL-60细胞，对高水平表达的端粒酶活性表现不出明显上调效应，经ATRA处理的HL-60细胞已降低的端粒酶活性可有效地上调，且发挥效应快。实验中使用5 %、20 %、40 % MCS可上调端粒酶活性，后两者的上调效应较对照有明显差异，提示未活化的腹腔巨噬细胞培养上清液中含有上调端粒酶活性的生物活性物质，且MCS上调端粒酶活性效应与活性物质含量正相关，而这类活性物质对高水平表达的端粒酶活性不足以进一步提高。Holt[7，8]等提出永生细胞端粒酶活性和细胞周期有关：即肿瘤细胞在G1/G0期开始表达端粒酶活性，到S期达峰值，在G2/M期几乎不表达端粒酶活性。也有报道用HT1080和HL-60试验发现白血病细胞周期中的各期细胞端粒酶活性无明显差异[8]。实验细胞Ⅰ受MCS 48 h作用后细胞进入S期有所增加，而端粒酶活性无明显变化。实验细胞Ⅱ受MCS作用，细胞进入G1/G0期增加，但端粒酶活性明显增高，提示在HL-60细胞中端粒酶活性与细胞周期关系不大。而以MCS直接作用于实验细胞的端粒酶提取物未发现酶活性明显变化，说明MCS不是通过化学或直接的生化作用，而是通过细胞发挥效应。实验结果提示诱导分化剂ATRA处理的HL-60细胞的端粒酶是可调节的，未活化的巨噬细胞培养上清液可有效上调其活性，而对HL-60细胞高水平表达的端粒酶活性影响不大。韩锐等[9]报道ATRA通过促进PKC活性及与核膜受体RARα结合，进入胞核，作用于靶基因而发挥诱导分化效应的，MCS上调ATRA处理的HL-60细胞端粒酶活性有可能通过拮抗以上的有关途径或其他未知环节来影响端粒酶活性。巨噬细胞促进肿瘤的生长存在细胞间的直接作用[2]，巨噬细胞又是分泌活性细胞，其产生多种生物活性因子在肿瘤细胞生长增殖中亦表现出复杂的作用，未活化的巨噬细胞培养上清可促进杂交瘤/瘤细胞生长增殖[3，4]。王宗惠[4]报道未活化的巨噬细胞培养上清液中存在具有促进NS-1、K562肿瘤增殖，提高YAC-1、L1210存活率的生物活性物质，这种生物活性物质是不同于白细胞介素1、6的。而活化的巨噬细胞培养上清液中的主要成分IL-1、TNF-α、IFN-γ具有杀伤瘤细胞效应。本实验中MCS短时间作用于ATRA处理的HL-60不能阻止细胞周期继续移行到G1/G0期；但在MCS持续作用2周后，细胞恢复恶性增殖状态，且生长代谢旺盛，多见核分裂相，胞浆内富含核糖体及高尔基体等细胞器。培养2周的对照组细胞存活量少，也见少量幼稚、大小不一的细胞，可能是少量对ATRA无反应的HL-60细胞群体部分[5]。其可能是一方面通过上调端粒酶活性，逆转分化细胞群体向恶性化发展或MCS促进对ATRA无反应的HL-60细胞群体增殖达到的。
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本文观察了MCS对HL-60细胞端粒酶活性影响，初步探讨其可能的作用机制。早衰综合征[10]、骨髓发育不良综合征患者细胞的端粒长度明显短于同年龄组正常人，利用MCS中这类上调端粒酶活性的物质用于早衰、骨髓发育不良综合征的预防和治疗是有可能的。
基金项目：四川省教委基金资助(川教科1996D027)
作者简介：周剑芳，女，硕士学位，在读博士生。
参考文献
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[2]Gorelin E.Inhibition of cytokine production by a tumor cell product〔J〕. Int J Cancer,1982,29:575
[3]陈慰峰，李 萌.巨噬细胞活性因子的双相效应及巨噬细胞的促瘤细胞生长作用〔J〕.中国免疫学杂志，1989，5：144
[4]王宗惠，庞祈民，苏 英，等.未活化巨噬细胞对杂交瘤/瘤细胞作用的研究〔J〕.肿瘤防治研究，1993，20：90
[5]Bestilny, Brown CB, Miura Y, et al.Selective inhibition of telomerase activity during terminal differentiation of immortal cell lines〔J〕.Cancer Res,1996,50:5795
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[6]Kim HW,Piatyszek MA.Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cell and cancer〔J〕. Science,1994,266:2011
[7]Zhu XL,Kumar R,Mandal M, et al. Cell cycle-dependent modulation of telomerase activity in tumor cells〔J〕. Proc Natl Acad Sci USA,Cell Biol,1996,93:6091
[8]Holt SE,Wright WE,Shay JW, et al. Regulation of telomerase activity in immortal cell lines〔J〕. Mol Cell Biol,1996,16:2932
[9]韩 锐主编.抗癌药物研究与实验技术〔M〕.北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1997：59
[10]Allosp RC,Vaziri H,Patterson C, et al. Telomere length predictive replicative capacity of human fibroblasts〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:101128
(收稿日期：1998-06-18 修回日期：1998-09-10), 百拇医药